Category: ICH-Q5A-生物技术产品的病毒安全性评估

3.2. 病毒检测方法： 用于检测内源性和偶发性病毒的检测方法有多种。表2列举了一些示例。制造商应该根据全面的病毒风险评估制定综合性的检测策略。所需要考虑因素包括：细胞系起源，传代历史，原材料和试剂，以及对原材料的灭活或去除病毒的处理方法。如果某种特定病毒的存在可能性相对较高，应包括特定的检测方法。 病毒检测方法需要有足够的灵敏度和特异性。此外，还应考虑潜在的基质干扰 （matrix interference)。 3.2.1． 逆转录病毒 对于生产中使用的细胞系，如主细胞库（MCB）及其后期培养细胞，必须进行逆转录病毒的检测，包括细胞上清液的感染性检测、逆转录酶（RT）活性的检测，以及使用透射电子显微镜（TEM）检查细胞中的病毒颗粒。如果已经知道细胞系含有逆转录病毒颗粒，可省略基于PCR的RT检测，但应通过TEM确定病毒颗粒类型。此外，对于检测到的逆转录病毒颗粒，需要使用特定的敏感细胞进行感染性测试，以确认其是否具有感染性。对于已经很好地表征其内源性逆转录病毒的细胞系，如中国仓鼠卵巢（CHO）、NS0、Sp2/0、Vero等，通常不需要进行化学诱导研究。化学诱导对于检测新的细胞系中未知的可诱导的内源性逆转录病毒很有帮助。 3.2.2． 体外细胞感染性测试 在体外细胞培养感染性分析中，研究人员通过将测试样品接种到能够检测多种人类和动物病毒的不同指示细胞培养中进行。这些指示细胞系包括与被测试细胞来源相同的细胞系、人类二倍体细胞（例如MRC-5）和猴肾细胞系（例如Vero）。 对于主细胞库（MCB）、工作细胞库（WCB）和最高传代细胞库（LIVCA）的资格认定，应在容许细胞上进行为期28天的测试，并在2周时进行至少一次亚代。应监测指示细胞培养液中的能导致细胞病变的病毒、吸附红细胞和凝集红细胞的病毒。 为了弥补体外细胞培养感染性分析的限制，如细胞系过于敏感，试验样品的干扰或毒性，可以使用NGS（二代测序）或其他分子方法来补充或替代这一分析。 3.2.3． 活体内测试 活体内测试是将测试物（见表2）接种到乳鼠、成年鼠和受精鸡蛋中，监测动物的健康状况和异常反应。 对于广泛使用的细胞系，如CHO、NS0和SP2/0，通常不需要进行活体内测试。如果主细胞库（MCB）或者工作细胞库（WCB）是在批准的控制条件下制备的，通常不需要对其进行测试。对于在LIVCA阶段的细胞，根据以往的知识和其他基于风险的考虑，测试可能也不是必需的。 由于其广泛和敏感的病毒检测能力以及活体内测试的局限性，鼓励使用非特异性NGS替代活体测试。此外，这符合替代、减少和改进动物测试的使用这一全球趋势。这些措施不仅可以提高测试的精确性和效率，还能在遵守伦理标准的同时减少对动物的依赖。 3.2.4. 特定病毒的测试 通过细胞的来源和潜在的病毒污染源确定细胞培养中需检测的特定病毒。例如，如果细胞系接触了牛血清或猪胰蛋白酶，就需要进行相应的人类、牛和猪病毒测试。 对于源自啮齿动物或接触过啮齿动物材料的细胞系，可以使用核酸扩增技术（NATs）或在小鼠、大鼠或仓鼠等动物中进行抗体生产测试来检测特定物种的病毒。常见的测试包括小鼠抗体生产（MAP）测试、大鼠抗体生产（RAP）测试和仓鼠抗体生产（HAP）测试。 此外，PCR检测、靶向或非靶向的下一代测序（NGS）等现代分子方法也可用于检测病毒污染，这些方法可以替代传统的动物测试，提供更快、更敏感且更符合伦理的病毒检测方案。 3.2.5. 分子方法 分子方法，如核酸测试技术（NAT）和下一代测序（NGS），已经被广泛用于病毒检测。NGS适用于非特异性检测已知和新型病毒，也可用于特异性检测。NGS可用于替代活体内实验。 a. NATs (Nucleic Acid Tests) 如 PCR (聚合酶链反应) 方法： NATs 通常单独使用或以多重格式应用，用于检测已知病毒或与之密切相关的病毒家族的病毒序列。这些分子方法可以作为细胞培养分析的补充，特别是在传统方法因干扰而受限时。NATs 特别有效于特定病毒的检测，尤其是那些难以通过感染性分析在细胞培养中生长的病毒。此外，NATs 还可以适应更广泛的病毒检测，如degenerated PCR。 b. NGS (下一代测序)： NGS 是一种高通量测序技术，已被证实能广泛检测病毒。它能提供明确的敏感性和广泛的病毒检测范围，能减少动物使用和测试时间。非靶向NGS可以替代活体测试，用于检测未知或意外的病毒种类，无需直接比较。此外，非靶向NGS也可以用来补充或替代体外细胞培养分析，以检测已知和未知或意外的病毒，这可以解决体外细胞培养感染性分析的限制,例如，细胞系对感染的敏感性和试验样品介导的干扰或毒性。NGS的应用包括细胞系表征、病毒种子和上游工艺培养液的测试，尤其适用于传统方法因技术干扰或毒性问题而不适用的情况。此外，NGS在样品准备、核酸提取、文库准备及生物信息学分析方面的高灵敏度和强大功能，使其成为现代病毒学研究和诊断的关键工具。 3.3 合格的细胞系 在制药过程中使用的某些细胞系可能包含内源性逆转录病毒、其他病毒或可能重新激活为感染性病毒的病毒序列。在这种情况下，制造的推荐行动计划将在第五部分详细描述。对于含有非内源性逆转录病毒的细胞系的可接受性，将由相应的监管机构根据产品的益处及其预期的临床用途、污染病毒的性质、这些病毒感染人类或引起人类疾病的潜力、产品的纯化过程（例如，病毒清除评估数据）以及对纯化批量进行的病毒测试的程度，进行个别考虑，并进行益风险分析

3. 细胞系中病毒的检测  在生物技术产品的生产中，保证细胞系质量的重要环节之一就是对病毒的检测。  3.1. 细胞库种类  相关的细胞包括主细胞库（MCB）、工作细胞库（WCB）以及体外细胞寿命极限细胞（LIVCA）。其中体外细胞寿命极限细胞代表病毒污染物扩增的最坏情况。  3.1.1. 主细胞库（MCB）  主细胞库需要广泛的内源性病毒和偶发病毒污染的筛查。对于异源杂交细胞系，如果来源或者部分来源于人类或非人灵长类动物，则应该对广谱和特异性病毒进行检测，如表1所述。检测方法应基于细胞系的起源和历史的风险评估，比如，在细胞系形成和细胞库存储过程中与来源于人类或动物的材料的接触是一种风险。  特殊情况下也可以通过在WCB（工作细胞库）上进行测试而来保证病毒安全性。   3.1.2. 工作细胞库（WCB）  每个WCB都应该进行根据表1 检测偶发病毒的污染。在特殊情况下，如果在MCB和LIVCA上进行了偶发病毒检测，那么在WCB上的类似测试可以省略。  3.1.3. 用于生产的体外细胞寿命极限细胞（LIVCA）  这些细胞代表生产终端的细胞，一般来说应进行病毒检测。这些测试（如表1所述）将进一步确保生产过程不会诱导内源性病毒、激活潜伏病毒或生长缓慢的病毒。如果在此阶段检测到任何新病毒，应仔细复查MCB和WCB。 对LIVCA细胞的研究可以在小型细胞培养的实验中，也可以在中试和商业化规模下进行。 3.2. 病毒检测方法：  用于检测内源性和偶发性病毒的检测方法有多种。表2列举了一些示例。制造商应该根据全面的病毒风险评估制定综合性的检测策略。所需要考虑因素包括：细胞系起源，传代历史，原材料和试剂，以及对原材料的灭活或去除病毒的处理方法。如果某种特定病毒的存在可能性相对较高，应包括特定的检测方法。  病毒检测方法需要有足够的灵敏度和特异性。此外，还应考虑潜在的基质干扰 （matrix interference)。  以上解读来自： 《Q5A(R2) Viral Safety Evaluation of Biotechnology Products Derived From Cell Lines of Human or Animal Origin》 《生物技术产品的病毒安全性评估：来源于人类或动物细胞系的产品》这是美国食品药品监督管理局（FDA）发布的指南，旨在指导如何确保生物技术产品不含有害病毒。这份文件是制药企业和监管机构确保产品安全的重要参考。 原始文件和更多信息可以在美国食品药品监督管理局官网找到。

2.  病毒的潜在来源 生物技术产品的病毒污染可能源于细胞系本身，或者在生产细胞系的生成、细胞库的建立以及生产过程中偶然污染。使用经过鉴定合格的细胞库和病毒种株可以降低病毒污染的风险。 2.1. 可能出现在主细胞库中的病毒 偶然病毒污染可以通过多种途径引入主细胞库（MCB），例如：(1) 从感染动物中衍生的细胞系；(2) 使用病毒建立细胞系；(3) 使用受污染的生物试剂（例如，用于筛选细胞的抗体）或细胞培养的原材料（例如，动物或人血清和猪胰蛋白酶）；或者(4) 在细胞库建立过程中的污染。 细胞可能有内源性逆转录病毒，这些内源性病毒可能会持续表达，或可能被某种条件激活产生具有感染性或不具有感染性的病毒颗粒。细胞也可能含有休眠的病毒或者持续存在的病毒（例如，疱疹病毒）。 2.2. 可能在生产过程中引入的偶然病毒 偶然病毒可能通过多种途径污染生产过程：(1) 在细胞培养中使用受污染的生物原材料或试剂，如动物血清成分；(2) 使用受污染的病毒种子进行生产；(3) 在下游纯化过程中使用受污染的原材料或试剂，如来自动物的抗体偶联亲和树脂；(4) 在配方过程中使用受污染的非活性成分；以及(5) 来自环境的污染或在细胞培养和培养基处理过程中的人为污染。 监测细胞培养参数（例如，细胞生长和存活率）也可以有助于早期检测偶然病毒的污染。制造商应尽可能避免在其生产过程中使用人和动物衍生的原材料（例如，人血清、牛血清、猪胰蛋白酶）。如果不能避免，则应进行风险评估。应提供如下信息：产地、组织来源、材料生产过程中的病毒灭活或去除步骤，以及测试的病毒类型的信息。根据风险评估，如果需要，应在灭活前进行这些测试。 在可能的情况下，应对有高风险引入偶然病毒的生物材料（如动物或人血清或猪胰蛋白酶）进行病毒灭活处理，如电离辐射。其他病毒风险缓解策略有细胞培养基（及补料）的处理，例如，病毒过滤、高温短时处理或紫外线C照射。 以上解读来自： 《Q5A(R2) Viral Safety Evaluation of Biotechnology Products Derived From Cell Lines of Human or Animal Origin》 《生物技术产品的病毒安全性评估：来源于人类或动物细胞系的产品》 这是美国食品药品监督管理局（FDA）发布的指南，旨在指导如何确保生物技术产品不含有害病毒。这份文件是制药企业和监管机构确保产品安全的重要参考。 原始文件和更多信息可以在美国食品药品监督管理局官网找到。

《Q5A(R2) Viral Safety Evaluation of Biotechnology Products Derived From Cell Lines of Human or Animal Origin》 《生物技术产品的病毒安全性评估：来源于人类或动物细胞系的产品》 这是美国食品药品监督管理局（FDA）发布的指南，旨在指导如何确保生物技术产品不含有害病毒。这份文件是制药企业和监管机构确保产品安全的重要参考。 原始文件和更多信息可以在美国食品药品监督管理局官网找到。 这份指南描述了对生物技术产品的病毒安全性评估，包括病毒清除和测试，并概述了在这些产品的上市申请中应提交的数据。生物技术产品包括生物制药和来源于人类或动物细胞系（例如哺乳动物、禽类、昆虫）的生物产品，比如亚单位疫苗。在这份指南中，“病毒”一词不包括与哺乳动物朊病毒，我们知道，朊病毒是导致牛海绵状脑病或俗称疯牛病的病原体。 这份指南包括使用重组DNA技术用体外细胞培养生产的产品，如细胞因子、单克隆抗体（mAbs）和亚单位疫苗。此外，这份指南还包括某些经基因工程改造的病毒载体和由病毒载体衍生的产品（例如病毒疫苗、基因治疗产品）。这些产品可以是基于AAV病毒载体的基因治疗产品或者用杆状病毒表达的病毒样颗粒（VLPs）、蛋白质亚单位以及基于纳米颗粒的蛋白质疫苗。 失活的病毒疫苗和减毒活病毒减毒疫苗和细胞疗法产品不在本指南的范围内。 为什么生物技术产品的病毒安全性很重要？这是因为用细胞系生产的产品可能会受到病毒污染，这种污染可能会导致严重的临床后果。 控制潜在的病毒污染的方法有三种： 值得注意的是，在重组蛋白工艺中的有效方法可能不适合基于病毒载体产品。因此，应考虑进一步降低风险的措施，例如原材料的处理和广泛的病毒检测。 病毒测试本身具有局限性。例如，检测低浓度病毒的能力受限于技术。因此，保证产品中没有病毒风险不仅仅需要直接检测，还需要证明纯化工艺能够去除或灭活病毒。 病毒检测方法和病毒清除的研究应考虑到每个产品和工艺的特殊性。产品开发商应该阐述确保病毒安全和预防病毒污染的策略，提供病毒安全评估的总结和病毒安全研究的详细数据。 一般来说，美国食品药品监督管理局（FDA）的指导文件没有法律效力。指导文件中的“应该” 一词不代表其必要性。企业可以采取不同的方法，只要能够合理地证明其方法同样有效。 以上解读来自： 《Q5A(R2) Viral Safety Evaluation of Biotechnology Products Derived From Cell Lines of Human or Animal Origin》 《生物技术产品的病毒安全性评估：来源于人类或动物细胞系的产品》 这是美国食品药品监督管理局（FDA）发布的指南，旨在指导如何确保生物技术产品不含有害病毒。这份文件是制药企业和监管机构确保产品安全的重要参考。 原始文件和更多信息可以在美国食品药品监督管理局官网找到。