3.2. 病毒检测方法：
用于检测内源性和偶发性病毒的检测方法有多种。表2列举了一些示例。制造商应该根据全面的病毒风险评估制定综合性的检测策略。所需要考虑因素包括：细胞系起源，传代历史，原材料和试剂，以及对原材料的灭活或去除病毒的处理方法。如果某种特定病毒的存在可能性相对较高，应包括特定的检测方法。
病毒检测方法需要有足够的灵敏度和特异性。此外，还应考虑潜在的基质干扰 （matrix interference)。
3.2.1． 逆转录病毒
对于生产中使用的细胞系，如主细胞库（MCB）及其后期培养细胞，必须进行逆转录病毒的检测，包括细胞上清液的感染性检测、逆转录酶（RT）活性的检测，以及使用透射电子显微镜（TEM）检查细胞中的病毒颗粒。如果已经知道细胞系含有逆转录病毒颗粒，可省略基于PCR的RT检测，但应通过TEM确定病毒颗粒类型。此外，对于检测到的逆转录病毒颗粒，需要使用特定的敏感细胞进行感染性测试，以确认其是否具有感染性。对于已经很好地表征其内源性逆转录病毒的细胞系，如中国仓鼠卵巢（CHO）、NS0、Sp2/0、Vero等，通常不需要进行化学诱导研究。化学诱导对于检测新的细胞系中未知的可诱导的内源性逆转录病毒很有帮助。
3.2.2． 体外细胞感染性测试
在体外细胞培养感染性分析中，研究人员通过将测试样品接种到能够检测多种人类和动物病毒的不同指示细胞培养中进行。这些指示细胞系包括与被测试细胞来源相同的细胞系、人类二倍体细胞（例如MRC-5）和猴肾细胞系（例如Vero）。
对于主细胞库（MCB）、工作细胞库（WCB）和最高传代细胞库（LIVCA）的资格认定，应在容许细胞上进行为期28天的测试，并在2周时进行至少一次亚代。应监测指示细胞培养液中的能导致细胞病变的病毒、吸附红细胞和凝集红细胞的病毒。
为了弥补体外细胞培养感染性分析的限制，如细胞系过于敏感，试验样品的干扰或毒性，可以使用NGS（二代测序）或其他分子方法来补充或替代这一分析。
3.2.3． 活体内测试
活体内测试是将测试物（见表2）接种到乳鼠、成年鼠和受精鸡蛋中，监测动物的健康状况和异常反应。
对于广泛使用的细胞系，如CHO、NS0和SP2/0，通常不需要进行活体内测试。如果主细胞库（MCB）或者工作细胞库（WCB）是在批准的控制条件下制备的，通常不需要对其进行测试。对于在LIVCA阶段的细胞，根据以往的知识和其他基于风险的考虑，测试可能也不是必需的。
由于其广泛和敏感的病毒检测能力以及活体内测试的局限性，鼓励使用非特异性NGS替代活体测试。此外，这符合替代、减少和改进动物测试的使用这一全球趋势。这些措施不仅可以提高测试的精确性和效率，还能在遵守伦理标准的同时减少对动物的依赖。
3.2.4. 特定病毒的测试
通过细胞的来源和潜在的病毒污染源确定细胞培养中需检测的特定病毒。例如，如果细胞系接触了牛血清或猪胰蛋白酶，就需要进行相应的人类、牛和猪病毒测试。
对于源自啮齿动物或接触过啮齿动物材料的细胞系，可以使用核酸扩增技术（NATs）或在小鼠、大鼠或仓鼠等动物中进行抗体生产测试来检测特定物种的病毒。常见的测试包括小鼠抗体生产（MAP）测试、大鼠抗体生产（RAP）测试和仓鼠抗体生产（HAP）测试。
此外，PCR检测、靶向或非靶向的下一代测序（NGS）等现代分子方法也可用于检测病毒污染，这些方法可以替代传统的动物测试，提供更快、更敏感且更符合伦理的病毒检测方案。
3.2.5. 分子方法
分子方法，如核酸测试技术（NAT）和下一代测序（NGS），已经被广泛用于病毒检测。NGS适用于非特异性检测已知和新型病毒，也可用于特异性检测。NGS可用于替代活体内实验。
a. NATs (Nucleic Acid Tests) 如 PCR (聚合酶链反应) 方法： NATs 通常单独使用或以多重格式应用，用于检测已知病毒或与之密切相关的病毒家族的病毒序列。这些分子方法可以作为细胞培养分析的补充，特别是在传统方法因干扰而受限时。NATs 特别有效于特定病毒的检测，尤其是那些难以通过感染性分析在细胞培养中生长的病毒。此外，NATs 还可以适应更广泛的病毒检测，如degenerated PCR。
b. NGS (下一代测序)： NGS 是一种高通量测序技术，已被证实能广泛检测病毒。它能提供明确的敏感性和广泛的病毒检测范围，能减少动物使用和测试时间。非靶向NGS可以替代活体测试，用于检测未知或意外的病毒种类，无需直接比较。此外，非靶向NGS也可以用来补充或替代体外细胞培养分析，以检测已知和未知或意外的病毒，这可以解决体外细胞培养感染性分析的限制,例如，细胞系对感染的敏感性和试验样品介导的干扰或毒性。NGS的应用包括细胞系表征、病毒种子和上游工艺培养液的测试，尤其适用于传统方法因技术干扰或毒性问题而不适用的情况。此外，NGS在样品准备、核酸提取、文库准备及生物信息学分析方面的高灵敏度和强大功能，使其成为现代病毒学研究和诊断的关键工具。
3.3 合格的细胞系
在制药过程中使用的某些细胞系可能包含内源性逆转录病毒、其他病毒或可能重新激活为感染性病毒的病毒序列。在这种情况下，制造的推荐行动计划将在第五部分详细描述。对于含有非内源性逆转录病毒的细胞系的可接受性，将由相应的监管机构根据产品的益处及其预期的临床用途、污染病毒的性质、这些病毒感染人类或引起人类疾病的潜力、产品的纯化过程（例如，病毒清除评估数据）以及对纯化批量进行的病毒测试的程度，进行个别考虑，并进行益风险分析
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